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Manual Técnico Baytril CERDOS II

Química

Los inhibidores de la girasa son sustancias químicamente similares a la 4-quinolona. El primer inhibidor de la girasa fue el ácido nalidíxico. Estos compuestos no se aislaron a partir de mohos u hongos, sino que se obtuvieron por síntesis en el tubo de ensayo del químico, circunstancia poco usual en la moderna investigación antibiótica. El ácido nalidíxico es más eficaz contra las bacterias gram-negativas que contra las gram-positivas, y ha demostrado su utilidad en el tratamiento de infecciones de vías urinarias. Debido a su especificidad contra bacterias gram-negativas ha sido ventajoso para ser empleado también en las infecciones intestinales. Desde su introducción a la clínica hasta la fecha, se han desarrollado para la terapéutica, otras sustancias químicamente similares a la 4-quinolona, como la enrofloxacina (Baytril), sin embargo el reciente descubrimiento de esta substancia difiere del ácido nalídixico en que éste es un derivado de la naftiridina, mientras que Baytril no posee ese esqueleto, perteneciendo químicamente al grupo de las piridopirimidinas, con lo que difiere no solamente del ácido nalidíxico, sino de otras quinolonas antiguas.

Baytril es por tanto una 4-quinolona fluorada, que se caracteriza por poseer mas de mil veces la potencia del acido nalidíxico, ejerciendo no solamente su acción sobre gérmenes gram-negativos y gram-positivos, sino que además presenta una alta especificidad contra micoplasmas. Asimismo se presentan marcadas diferencias cuantitativas en la actividad por unidad de peso de la droga. Esta substancia se caracteriza por inhibir a una enzima denominada girasa, que es requerida durante los procesos de replicación, transcripción o recombinación del ácido desoxirribonucleico. También interviene en los mecanismos de reparación del mismo ácido.

Pero, ¿cuál es el mecanismo de acción de Baytril? Para explicar su mecanismo de acción, sería adecuado pensar en lo que ocurre con Escherichia . coli (Figura 1). donde se muestra el modelo de estructura bacteriana y se cuenta con un parámetro correcto para representar las proporciones de las dimensiones que requerimos. Por un lado el cromosoma, compuesto por dos cadenas de ácido desoxirribonucleico de 1300 micrómetros de longitud, que tiene que entrar en una envoltura bacteriana con una superficie de sólo dos por un micrómetros.

En una serie de estudios de Worcel en 1974, se observó cómo es que el cromosoma de E. coli se dobla en una serie de regiones espaciales de organización, a las que denomino "Dominios" o "Enrollamientos".

Cada dominio. se concluyó, mide aproximadamente 20 micrómetros de longitud y se encuentra unido a un núcleo del ácido ribonucleico (Figura 2). La necesidad de espacio obliga a cada uno de esos dominios a condensarse dominio a dominio, de ahí el termino de "Dominios de Superenrollamiento" (Figura 2).

Como el cromosoma de E. coli tiene una longitud de 1300 micrómetros, contiene por lo tanto, 65 dominios de superenrollamiento y el número de superenrollamientos de cada dominio se puede calcular en unos 400. Se sabe que sus espirales se enrollan en sentido contrario a las hélices del ácido desoxirribonucléico, tratándose por tanto de un Superenrollamiento "negativo". En 1976 Crumplin y Smith descubrieron que la acción especifica de los inhibidores de la girasa consistía en que durante la replicación del cromosoma de E. coli, se producía un apelotonamiento anormal de los predecesores del ácido desoxirribonucléico de una sola hélice, por lo que se pudo concluir que la acción especifica del compuesto era el causar un acumulamiento de los precursores, ya que la droga impide en forma muy específica el que los precursores formen un ácido desoxirribonucleico cromosomal maduro. Smith en 1984. al comparar conjuntamente sus resultados con los de Worcel pudo deducir lo siguiente: los dominios del cromosoma se superenrollan unas 400 veces, esto sucede independientemente en cada dominio, es decir en forma separada, para lo cual se abre pasajeramente la doble hélice del cromosoma, dominio a dominio, cortándose las dos hebras en forma escalonada. Cuando se ha completado el superenrollamiento, los extremos de los dominios superenrollados se unen de nuevo. La enzima responsable del cierre es inhibida específicamente por una acción antienzimática, la consecuencia dc esta inhibición salta a la vista: la forma fisiológica normal del cromosoma se modifica hacia una forma de desarrollo más precaria. aumentando de esta manera la necesidad de espacio para el ADN. Como se puede observar en la Figura 3. se producen cortes escalonados por la acción de la inhibición enzimática, aumentando la necesidad de espacio para el ADN, quedando los extremos expuestos. El ADN expuesto actúa como una señal de alarma para inducir una producción de exonucleasas. Al producirse tales exonucleasas se fragmenta el ADN cromosómico, lo que significa naturalmente la muerte de la bacteria.

En 1976 Gellert y sus colaboradores identificaron a la enzima que cortaba la doble hélice del ácido desoxirribonucléico cromosómico, inductora de superenrollamientos negativos y que finalmente volvía a cerrar de nuevo la doble hélice de ADN. Lo denominaron ADN girasa o E. Coli topoisomerasa II. Esto vino a confirmar, por tanto, la existencia de tal enzima, existencia postulada ya antes por Crumplin y Smith en 1976. Y aún cuando la topoisomerasa I fue conocida en forma anterior a los trabajos de Gellert y a partir de la cual se han descrito diversas topoisomerasas, los descubrimientos de Gellert fueron únicos, ya que la girasa del ADN es la única topoisomerasa que provoca superenrollamientos negatives en el ADN bacteriano. Por lo tanto, la ADN girasa es de importancia central para entender la acción antibacteriana de aquellos agentes que actúan en forma especifica sobre esta enzima.

La E. coli topoisomerasa II consta de cuatro subunidades. Dos monómetros con un peso molecular de 105000 dal-tons y dos monómeros con un peso molecular de 95000 daltons. Las subunidades alfa se cree sean respon-sables de la inducción de los superenrrollamientos negativos en los dominios en cadenas dobles de ADN, mientras que las subunidades beta son responsables de 1: la apertura del ADN en los dominios aislados, es decir que inducen cortes escalonados en las distintas hélices del ADN del cromosoma bacteriano y 2: el nuevo cierre de los puntos de ruptura. Según Gellert, la acción antibacteriana de los inhibidores de la girasa radicaba en impedir el cierre o reparación de estos puntos de ruptura debidos a la acción de las subunidades de la ADN girasa. Sin embargo, pudo ser demostrado por Sugino y colaboradores en 1977 así como por Gellert y colaboradores en el mismo año, que se puede presentar una unión covalente anormal entre el ADN fragmentado y la ADN girasa. Posteriormente Morrison y Cosharelli demostraron que los cortes producidos por las subunidades alfa la ADN girasa aparecen escalonados cada cuatro pares de bases y que el extremo 5' sobresale de la cadena (Figura 3). Los inhibidores de la girasa enlazan precisamente este extremo 5' del ADN con la girasa mediante una unión o puente covalente anormal. Además de los descubrimientos hechos con la ADN girasa de E. Coli, se han encontrado girasas similares también en pseudomonas y en micrococos.

La resistencia relativa de estos microorganismos al ácido nalidíxico se correlaciona con la ausencia de sensibilidad de sus girasas frente a éste.Una de las características más importantes de un antimicrobiano es la selectividad que debe presentar para matar bacterias sin producir daño alguno al macroorganismo. Las células de los organismos superiores, como las de los mamíferos son muy similares bioquímicamente, por lo que ha sido necesario establecer una selectividad en la acción de los diferentes antimicrobianos. Dadas estas similitudes ¿cómo es posible que pueda matar bacterias sin causar daño al macroorganismo? Aún cuando las bacterias, como las células de los mamíferos, poseen material genético ADN de tipo bicatenario, en su estructura existen diferencias fundamentales. Las bacterias contienen sólo un cromosoma formado por una laxa combinación de 70% de ADN. 20% de ARN y solo 10% de proteína (ARN polimerasa). El cromosoma bacteriano no está envuelto por una membrana y se concatena, como ya se ha dicho, en unos 65 dominios o zonas condensadas, como consecuencia del superenrollamiento producido por la ADN girasa. En cambio cada célula de los mamíferos superiores posee un número especial. En el caso del hombre, el ADN se encuentra rodeado por una membrana que contiene normalmente 46 cromosomas aislados. Cada cromosoma humano se compone de cromatina, sustancia compuesta en un 50% por pequeñas proteínas básicas denominadas histonas, unidas intimamente a una cantidad equivalente de ADN.

Liu y colaboradores en 1983 y Millery colaboradores en 1981 encontraron que las células mamíferas poseen una topoisomerasa II, que es bastante similar a la ADN girasa bacteriana, la cual es responsable de producir dos cortes escalonados en el ADN bicatenario alejados uno de otro por cuatro pares de bases, dejando libre el extremo 5'. Otra diferencia es que la enzima mamífera esta compuesta por dos subunidades (en lugar de cuatro), cada una con un peso molecular de 172000 daltons.

Por otra parte una acción de superenrollamiento negativo no es detectable, lo que hace aún mayor la diferencia. Finalmente, la enzima mamífera no es susceptible a la inhibicion por los ácidos nalidiíxico u oxolínico in vitro, como lo es la girasa de E. coil. La importancia de esta enzima mamífera no se ha aclarado aún del todo. Probablemente sea necesaria para la primera etapa de la reducción longitudinal del ácido desoxirribonucléico y que podría tener lugar de la forma siguiente:Existen 5 tipos de histonas (HI, H2a. H2b, H3 y H4); las cuatro ultimas se unen entre si, resultando un dímero (H2a:H2b) y un tetrámero (H3:H3: H4:H4)( White y cols. 1978). Al unirse un tetrámero con dos dímeros se forma un complejo histónico rodeado de ADN, dando así lugar a un nucleo-soma (Figura 4). Estos nucleosomas están separados uno de otro por cortos tramos de ADN, permaneciendo en contacto con la histona HI restante. Es posible que la topoisomerasa II, en el caso de los mamíferos, realice este enrollamiento del ADN en las histonas para producir cromatina. De esta manera es esencial para el ADN mamífero ya que en su organización cromosomal se encuentra en paquetes muy densos, pues cada cm. de ADN en los mamíferos ocupa solamente una micra de longitud del cromosoma. Pudiera ser que la topoisomerasa II de origen mamífero sea requerida para provocar, en forma transitoria, un enrollamiento en las histonas del ADN altamente condensado; permitiendo si fuera así, que una pequeña cantidad de ADN mamífero se superenrolla negativamente y que sería requerido para regular la transcripción de ARN. Esto podría explicar la diferenciación que ocurre dentro de distintas células mamíferas, o bien entre diferentes tejidos.

Doble Mecanismo Bactericida

El Baytril (Enrofloxacina), posee una actividad bactericida que se caracteriza por ser de 600 a 5,000 veces mas potente que otros inhibidores de la girasa conocidos hasta la fecha, como por ejemplo el ácido nalidixico, ácido pipemídico, y la flumequina. En la práctica clínica es de fundamental importancia el hecho de que Baytril alcanza su concentración máxima bactericida en el suero, en contraposición a otros inhibidores de la girasa, como por ejemplo el ácido nalidixico, en el que la concentración máxima bactericida sólo se logra en la orina, quedando su concentración sérica muy por debajo, por lo que su utilización en infecciones sistémicas es limitada. Aun cuando el esqueleto químico de todos los antibacterianos cuatro-qui-nolónicos hayan tenido alguna similitud en su origen, hoy en día existen marcadas diferencias que se hacen patentes no sólo en su estructura, sino también en lo que se refiere a su actividad biológica por unidad de peso de la droga.

Este marcado incremento en la actividad biológica de Baytril se debe a que posee dos sitios de unión al ADN bacteriano, a diferencia de otros inhibidores de la girasa que ejercen su acción sobre un sólo punto.

Este doble sitio de acción se demuestra cuando se le agrega in vitro a un medio de cultivo rifampicina, un inhibidor de la síntesis de ARN, ya que como se sabe, los productos antiguos como el ácido nalidixico, la flumequina, rosoxacina. ácido pipemidico. cinoxacina y el ácido oxolinico, pierden por completo su actividad bactericida reduciéndose su efecto a una simple bacteriostasis, en tanto Baytril sólo disminuye su potencia bactericida a un nivel no demostrable bajo condiciones prácticas. Por lo tanto se deduce que existe un mecanismo de acción común a todos los derivados quinolónicos, mientras que el que se observa en Baytril posee un segundo y único mecanismo bacteriano, por ello su efecto bactericida es sumamente rápido, actuando en unos cuantos minutos, en tanto que otros inhibidores de la girasa requieren más del doble de tiempo para realizar su efecto bactericida sobre el 90% de la población bacteriana. Además debe considerarse la cantidad de droga requerida y los efectos secundarios a esperar.

Es por este mecanismo de acción adicional por lo que se obtienen sorprendentes resultados en la actividad de Baytril frente a mutantes bacterianos de laboratorio que presentan resistencia al ácido nalidíxico y otros inhibidores de la girasa. El efecto bactericida del ácido nalidixíco también desaparece cuando existe una inhibición de la síntesis proteínica como ocurre por ejemplo, al utilizar el cloramfenicol u otros antibióticos, por ello se encuentra contra indicada cualquier asociación entre estos dos tipos de fármacos, mientras que la actividad bactericida de Baytril se mantiene, con lo que se confirma nuevamente que este posee dos mecanismos de acción bactericida, lo que elimina un posible problema de antagonismo farmacológico, y a su vez permite que Baytril pueda ser utilizado aún en combinación con otros quimioterápicos sin perder su excelente poder bactericida.

Estudios con microscopio electrónico, del efecto de un derivado del ácido quinolón-carboxílico sobre la ultra-estructura de bacterias coli y estafilococos in vitro.

Para la visualización del efecto de un derivado del ácido quinolón-carboxílico sobre la estructura celular de bacterias gramnegativas y grampositivas se utilizaron cepas. resistentes al suero, de E. coli C 14 y de Siaphylococcus aureus 25151 (Foto 1). Para aproximarse a las condiciones in vivo reales, se cultivaron bacterias en suero activo. Pasadas dos horas de la adición de un derivado del ácido quinolón-carboxílico al medio de cultivo en concentraciones de 0.025-2,0 mcg/ml, las células fueron fijadas en una mezcla de glutar-aldehí-do/tetraóxido de osmio, deshidratadas por pases en alcohol e incluidas en Epon 812. Por último, cortes ultrafinos de las bacterias fueron contrastadas con soluciones de citrato de plomo y acetato de uranilo, y fotografiadas a través de un microscopio electrónico Philips.

En dependencia de las concentraciones de substancia aplicada, se produjeron las siguientes alteraciones de las células bacterianas:

Con cantidades bajas de substancia activa, se produce un alargamiento de los gérmenes gramnegativos. Alteraciones estructurales precoces radican en distintos enponjamientos periféricos del plasma bacteriano (Foto 2, flecha). A medida que aumentan las concentraciones, se produce entonces una lisis y la ruptura de las membranas celulares (Foto 3). En los estafilococos, las lesiones empiezan con deformaciones de los tabiques, así como de la célula bacteriana en su totalidad (Foto 5), culminando finalmente con una proteólisis y con envolturas bacterianas vacías (foto 6).

Bibliografía

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